젓갈로부터 Bacillus safensis JIF 17718 효소활성 균주의 분리 및 최적 배양 조건 확립

음식물 쓰레기의 분해가 가능한 유용 균주를 선발하기 위하여 6종의 젓갈(새우젓, 멸치젓, 굴젓, 명란젓, 창란젓, 밴댕이젓)로부터 균주를 분리하였다⁶⁾. 채취한 시료 10 g을 각각 멸균된 증류수에서 3시간 동안 침지시킨 후 Nutrient Agar (0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar) 배지(Difco, USA)에 도말하여 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후 배지에 나타난 colony의 크기와 형태에 따라 서로 다른 colony를 선발하여 각각 NA 배지에 옮겨 배양한 후 단일 균주를 분리하였다.

분리된 균주의 효소활성 유무를 확인하기 위하여 protease, amylase 및 cellulase 활성을 평가하였다^8,9). 효소활성이 높은 균주를 선별하기 위해 paper disc (Advantec, Japan) 방법을 이용하였고, 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질성분이 포함된 고체 선별배지를 사용하였다. Protease 활성은 1% skim milk (Difco, USA)를 첨가한 NA 배지에 6 mm paper disc를 올리고, 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 반응하여 분해능을 억제환의 직경으로 조사하였다. Amylase 활성 확인은 starch agar (0.3% beef extract, 1% soluble starch, 1.2% agar) 배지(Difco, USA)에 6 mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤 lugol solution (Sigma, Swizerland)으로 염색하고 분해능을 억제환(clear zone)의 직경으로 조사하였다. Cellulase 활성 확인을 위하여 1% CMC가 포함된 NA 배지에 6 mm paper disc를 올리고, 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양 후 0.1% congo red로 30분간 염색하고, 1N NaCl로 세척한 뒤 나타난 억제환의 직경으로 조사하였다. 분리된 균주의 효소활성 분해능 평가는 배양 후 나타나는 disc 주위의 억제환의 크기(+++++ : 25~ 30 mm, ++++ : 20~25 mm, +++ : 15~20 mm, ++ : 10~15 mm, + : 0~10 mm, - : trace)로 나타내었다.

효소활성을 갖는 분리된 균주로부터 염색체를 분리한 후 16s-rRNA를 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통하여 증폭하였다. PCR primer sequence로는 785F 5'(GGATTAGATACCCTGGTA) 3', 907R5'(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)3'를 사용하였다. PCR로 증폭된 RNA는 vector를 이용하여 형질전환시킨 후, 형질전환된 plasmid RNA를 분리하여 염기서열을 분석한 다음 계통분류학적 비교․분석을 통하여 균주를 동정하였다¹⁰⁾.

젓갈 6종으로부터 음식물쓰레기를 분해할 수 있는 효소활성 균주를 분리한 결과(Table 1), 225종의 균주를 분리하였으며, 이 중 5% NaCl 내염조건과 30~50℃에서 생육이 가능한 균주 75종을 확보하였다.

분리된 균주의 내염성 활성평가를 위하여 0%, 3%, 5% NaCl이 첨가된 고체 배지상에서 균주의 성장 여부를 확인하였다. 우리나라 음식에 포함되는 염분 농도는 대체로 고염의 특성을 가지므로 5% NaCl 내염성을 가진 균주가 음식물 쓰레기 분해 균주로 활용이 가능하다고 판단하였다. 젓갈에서 분리한 225균주 중에서 5%의 염도에서는 75균주가 생육 및 배양이 가능함을 확인하였다(Table 1).

분리된 균주의 내열성 활성평가를 위하여 30℃, 40℃, 50℃의 배양 조건(WIG-155, DAEHAN science, Korea)에서 분리 균주의 성장 여부를 확인하였다. 각각의 온도에서 분리 균주를 배양한 결과, 젓갈에서 분리한 225균주 중 5% NaCl 조건에서 내염성을 가지면서 30℃에서 생육이 가능한 균주는 29균주, 40℃에서는 26균주 그리고 50℃에서 20균주가 배양이 가능하였다(Table 1).

국내에서 배출된 음식물 음폐수의 평균 염도는 약 3~5% 수준이므로 본 연구에서는 5%에서 분리된 75균주를 대상으로 protease, amylase 및 cellulase 효소활성을 평가하였다. 분리된 균주의 효소활성을 평가한 결과(Table 2), 젓갈에서 분리된 225 균주 중 30℃에서 protease 활성을 보이는 균주 19종, amylase 활성을 보이는 균주 10종, cellulase 활성을 보이는 균주를 16종을 확보하였다. 40℃에서 protease 활성을 보이는 분리균주를 20종, amylase 활성을 보이는 균주 13종, cellulase 활성을 보이는 균주를 16종을 확보하였으며, 50℃에서 protease 활성을 보이는 분리균주를 19종, amylase 활성을 보이는 균주 14종, cellulase 활성을 보이는 균주 20종을 확보하였다. 본 연구에서는 3가지 이상의 효소활성을 가지며, 15mm 이상의 clear zone을 나타내는 균주 19종을 우선 선발하였다.

3가지 이상의 효소활성을 가지며, 15mm 이상의 clear zone을 나타내는 균주 19종을 대상으로 분자생물학적 동정을 진행한 결과(Fig. 1), Bacillus safensis JIF 17718 균주를 포함하여 5종의 균주가 동정되었다. Bacillus safensis 균주는 그람 양성, 포자 형성 막대 균주로서 10~50℃의 최적 온도 범위를 가지며, 0~10%의 내염성을 가지고 있는 균주로 알려져 있어 음식물쓰레기 분해과정 중 내염성에 적합한 균주로 판단되었다.

Fig. 1. Genetic identification of Bacillus safensis JIF 17718 strain.

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